ETAPA 1: Conheça as técnicas

 

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

 

Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA.

 

Essa técnica utilizada os seguintes componentes:

- Tubos de ensaio contendo o DNA que será copiado

- Máquinas de PCR: que regularam a temperatura, esfriando e aquecendo ao longo do processo.

- DNA polimerase: enzima que faz a replicação do DNA.

- Nucleotídeos de DNA: que se juntaram aos primers para formas as novas fitas de DNA.

- Primers: fitas de DNA com mais ou menos 20 bases nitrogenadas complementares aos fragmentos que iniciam a sequência de DNA.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Procedimento:

- A máquina de PCR aquece e separa as fitas do DNA que será amplificado.

- A máquina resfria e os primers se ligam ao início de cada uma das fitas, servindo de iniciadores para a enzima DNA polimerase.

- A máquina aquece novamente e a enzima DNA polimerase adiciona nucleotídeos livres, formando uma nova fita dupla de DNA.

- O ciclo pode ser repetido para criar ainda mais cópias do DNA.

 

 

 

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Procedimento:

- O DNA é dividido em fragmentos com a ação de enzimas de restrição.

- Um gel é feito a partir de agarose (um açúcar que se dissolve em água fervente e se gelifica quando esfria)

- Os fragmentos de DNA são introduzidos em pequenos poços de gel numa placa.

- o DNA que é negativamente carregado é exposto a uma corrente elétrica e então atraído pelo eletródo positivo, migrando através do gel.

- Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os maiores, ficando em posições diferentes na placa.

- Cálculos matemáticos baseados em log10 são utilizados para descobrir o tamanho exato dos fragmentos de DNA com base em sua velocidade de migração.

- Os fragmento de DNA são corados e tornam-se visíveis em luz ultravioleta.

- Quando observados em luz ultravioleta percebe-se que os fragmentos de DNA formaram bandas, faixas de DNA, correspondentes aos seus tamanhos.

- Fragmentos de DNA podem ser isolados e purificados.

 

 

 

ETAPA 2: SIMULE A REALIZAÇÃO DESTAS TÉCNICAS

 

As técnicas de PCR e Eletroforese são aplicadas em diversos tipos de pesquisa científica. Entre elas, podemos citar a busca de criminosos entre suspeitos e os testes de paternidade realizados a partir de amostras de DNA.

 

Testes de Paternidade

 

"O teste de paternidade compara o DNA dos pais com o do filho, com probabilidade de 99,9% de acerto para determinação da paternidade. Simplificadamente, nessa técnica, o DNA dos indivíduos é isolado multiplicado por meio de uma técnica denominada Reação em Cadeia da Polimerase - PCR, na qual são realizados ciclos de alteração de temperatura e usadas enzimas, fragmentos para iniciar a síntese de DNA e nucleotídeos que   possibilitarão que uma pequena quantidade de DNA seja aumentada muitas vezes.    

Após essa etapa de amplificação, o DNA é quebrado em fragmentos através das chamadas enzimas de restrição, que são capazes de clivar regiões específicas das moléculas de DNA. Esses fragmentos são separados por tamanho e não por sua sequência de bases (ou nucleotídeos) através da técnica de eletroforese, gerando uma espécie de imagem fotográfica semelhante a um código de barras. Esse “código de barras” é a “impressão digital” do indivíduo. Os resultados são comparados, podendo identificar os pais indivíduo. Vale lembrar que o exame de DNA não compara a informação genética dos indivíduos, mas apenas os tamanhos dos fragmentos obtidos de suas moléculas de DNA."

TRANSMISSÃO DA VIDA ÉTICA  E MANIPULAÇÃO GÊNICA. OS FUNDAMENTOS DA HEREDITARIEDADE: Teste de Paternidade. UNICAMP, agosto 17, 2011. 

 

 

 

Imagine que um adolescente criado apenas pela mãe deseja saber quem é seu pai. Sua mãe, que não tem um bom relaciomento com este homem, diz ao filho que trata-se de um ex-namorado, mas que não quer revelar a identidade dele. Curioso, o filho adolescente consegue o contato de quatro ex-namorados de sua mãe e convida-os para fazer o teste de paternidade.

 

- Supondo que a mãe seja o indivíduo A;

- Sabendo que o filho é o indivíduo F e que sua sequência genética já está identificada no gabarito;

- Tendo como supostos pais os indivíduos B, C, D e E; 

Siga os passos abaixo e descubra quem é o pai do adolescente em questão:

 

1. Simule cortes realizados pelas enzimas de restrição nos fragmentos de DNA 

        Cada pessoa representada na tabela por uma letra tem seus cromossomos homólogos representados em duas colunas. Cada coluna traz as sequências de bases, que podem ser diferentes entre si. O primeiro passo para comparar amostras de DNA é cortar estas moléculas com enzimas de restrição. Nesse exercício as enzimas de restrição atuariam separando pares de C-G / C-G ou G-C / G - C seguidos.

        Assim, toda vez que aparecerem duas vezes seguidas a base C em uma das fitas do DNA e a base G em outra, faça um risco com uma caneta colorida no material abaixo simulando o corte dos fragmentos de DNA. Repare que no indíviduo A isto já foi feito, siga o exemplo.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Conte os tamanhos de cada fragmento de DNA

        Conte quantos pares de bases há entre suas demarcações com caneta. (Repare que no indíviduo A isto já foi feito. Siga como exemplo).

 

3. Simule a imagem da eletroforese

        Pinte os quadrados que representam as bandas no gel de eletroforese toda vez que um indivíduo tiver um fragmento de DNA do tamanho que o quadrado representa (Repare que no indíviduo A isto já foi feito, siga como exemplo).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Compare os padrões de banda da criança com os padrões da mãe

         Verifique quais fragmentos de DNA a criança apresenta e que a mãe também apresenta. Imagine que estas sejam sequências que ela herdou da mãe e concentre sua atenção naqueles fragmentos que a mãe não tem, estes devem ter sido herdados do pai. 

 

5. Compare os padrões de banda da criança com os supostos pais.

        O pai da criança deverá apresentar, simultaneamente, todos os fragmentos de DNA que a criança tiver e a mãe não tiver. Assim, que você encontrar estes fragmentos em um suspeito, você provavelmente terá achado o pai da criança. Confirme se não errou nenhuma análise e, então, poderá afirmar quem é o pai dentre os três suspeitos.

 

 

 

IDENTIFICAÇÃO DE CRIMINOSOS

 

Quando amostras de DNA são encontradas em cenas de crime e há indivíduos suspeitos é possível identificar o criminoso por um mecanismo bem parecido com o realizado em testes de paternidade. Após ampliar a quantidade de DNA através do PCR, a eletroforese e os padrões de bandas formados no gel permitem esta identificação. 

 

Dando continuidade ao exercício realizado acima e supondo que o indivíduo G (cuja sequência genética já está preenchida no gabarito) represente a amostra de DNA encontrada em baixo da unha de uma vítima, assassinada após lutar com seu assassino:

 

1. Compare os padrões de banda e determine qual dos indivíduos é o assassino.

2. Explique como chegou a esta conclusão.